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MLPA（Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification）是一种分子生物学技术，主要用于检测基因组中特定DNA序列的拷贝数变异（Copy Number Variations, CNVs）和部分点突变。该技术由荷兰MRC-Holland公司在2002年开发，因其高效、特异、快速和简便的特点，在遗传病诊断、肿瘤基因组学、基因分型等领域得到广泛应用。以下是关于MLPA技术的主要特点、工作原理、优点和局限性的概述：

工作原理

1. 特异性探针设计
MLPA利用一系列短的寡核苷酸探针，每个探针设计成能够特异性地与目标DNA序列的相邻区域杂交。探针分为两部分：一个是与目标序列配对的互补区，另一个是含有通用引物结合位点和特定标签序列的连接子（ligation probe）。探针的两端通常带有所需的酶切位点，便于后续处理。

2. DNA片段化与探针杂交
首先，待测样本DNA经过限制性内切酶消化，形成片段化的DNA。然后，设计好的探针混合物与这些片段化DNA在适当的条件下进行过夜杂交，使得探针的两个互补部分分别与目标序列两侧的DNA片段相连。

3. 连接与富集
杂交成功的探针通过连接酶进行连接，形成完整的、带有通用引物结合位点和标签序列的DNA分子。这一过程仅发生在探针完全匹配且相邻的目标序列存在的情况下，从而确保了反应的特异性。未成功连接的探头会被后续步骤去除。

4. PCR扩增与检测
连接后的探针通过PCR（聚合酶链式反应）进行扩增，使用一对通用引物，它们能识别所有连接探头上的通用引物结合位点。扩增产物含有特定的标签序列，这些标签序列可以通过毛细管电泳、微阵列芯片分析或高通量测序等方法进行区分和定量。

优点

1. 高效
一次MLPA反应可同时检测数十至上百个不同的靶序列，实现对多个基因或基因片段的拷贝数变异进行并行分析，大大提高了检测效率。

2. 特异
每个探针针对特定的DNA序列设计，结合连接反应的严格条件，保证了检测的特异性。可以准确识别基因缺失、重复、扩增等CNVs。

3. 快速
从DNA准备到数据分析，整个流程可在24小时内完成，为临床决策提供快速的分子诊断信息。

4. 简便
实验步骤相对固定，操作流程标准化，对实验室设备要求相对较低，易于在常规实验室中实施。

局限性

1. 技术要求高
尽管操作相对简单，但MLPA对样品质量、DNA纯度、浓度的精确测量以及实验过程中的污染控制要求较高，否则可能影响结果的准确性。

2. 单细胞分辨率不足
MLPA无法应用于单细胞水平的检测，因为它依赖于大量DNA模板进行反应，无法反映出单个细胞内的基因组变异。

3. 对点突变检测有限
虽然MLPA可以检测部分点突变，但其主要优势在于CNV检测，对于未知或罕见的点突变类型检测能力有限，通常需要结合其他技术（如Sanger测序、NGS等）进行验证或补充。

4. 无法检测平衡易位
MLPA仅能检测拷贝数的变化，对于没有导致拷贝数改变的染色体结构变异，如平衡易位，无法直接识别。

应用领域

MLPA技术广泛应用于以下领域：

– 遗传病诊断：检测遗传性疾病相关的基因缺失、重复或突变，如Duchenne muscular dystrophy（DMD，杜氏肌营养不良症）、Prader-Willi syndrome（普拉德-威利综合征）、Angelman syndrome（天使人综合征）等。

– 肿瘤基因组学：评估肿瘤细胞中与疾病发生、进展或治疗反应相关的基因CNVs，如HER2基因在乳腺癌中的扩增。

– 产前筛查与诊断：检测胎儿DNA中与遗传性疾病相关的CNVs，如非整倍体筛查、微缺失/微重复综合征检测。

– 法医鉴定：用于亲子鉴定、个人识别或犯罪现场DNA分析中的CNV分析。

– 基因分型：在遗传学研究中用于快速、大规模地确定样本群体中特定基因座的多态性。

总之，MLPA作为一种强大的分子诊断工具，特别适用于大规模、高通量的基因拷贝数变异检测，尽管存在一定的局限性，但在很多临床和科研场景中仍发挥着重要作用。随着技术的不断发展和完善，其应用范围和性能可能会进一步提升。